Falsi positivi rilevati dai test PCR
Una spiegazione dei falsi positivi nella qRT-PCR: cosa sono e come si verificano. Falsi positivi che contribuiscono pesantemente all'incremento delle ormai famose "curve" sulle quali i regimi sanitocratici impongono alla popolazione ogni sorta di restrizione delle libertà individuali.
Questa è una spiegazione dei falsi positivi nella qRT-PCR: cosa sono e come si verificano. qRT-PCR è il tipo di PCR utilizzato per testare COVID-19 ed è l'acronimo di 'Semi-Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction' (un po 'un boccone, quindi a volte le persone dicono semplicemente' Il test PCR '). Per decomprimere qRT-PCR e comprenderne l'uso / i, dobbiamo fare un passo indietro e pensare alle informazioni genetiche e alla PCR a tutto tondo.
I tuoi geni e come la PCR amplifica piccole quantità di DNA
L'informazione genetica di molte specie è costituita dal DNA. Questo è vero (per quanto ne sappiamo) per tutti i batteri, funghi, protozoi, piante, insetti e vertebrati, incluso te. Se hai bisogno di studiare il DNA da un piccolo campione di uno di questi, puoi amplificarne una parte usando la PCR (reazione a catena della polimerasi - arriveremo alla parte 'RT' tra un minuto). Questo è mostrato nella Figura 1a . La PCR è incredibilmente sensibile. Può iniziare con una singola molecola di DNA e rapidamente (in un paio d'ore) amplificarne una parte per produrre miliardi e miliardi di copie, abbastanza per studiarla in profondità. La PCR è ampiamente utilizzata nella ricerca, clinicamente e nella medicina legale: il DNA genomico in una minuscola macchia di sangue può essere amplificato dalla PCR in modo che i ricercatori possano combinarlo con altri test per mostrare se il sangue proviene dal Sospetto A o dal Sospetto B.
Per sapere (in generale) se la PCR ha funzionato, i potenziali prodotti della PCR possono essere separati e visualizzati su un sistema gel. Il gel ti dice quanto è lungo il prodotto della PCR, il che ti dà un'idea se hai amplificato il target previsto (cosa che non sempre accade), e contiene un controllo negativo per mostrare che la PCR non ha amplificato un prodotto non intenzionale, come un contaminante. Entrambi sono molto importanti e vengono considerati di seguito.
La PCR odierna viene spesso misurata da macchine piuttosto che da sistemi gel. Con una combinazione di luce, rivelatori e una chimica intelligente dei coloranti fluorescenti, è possibile che la macchina rilevi l'amplificazione PCR non appena si verifica, in "tempo reale". La PCR in tempo reale viene talvolta definita qPCR, per la PCR semiquantitativa. qPCR è immensamente potente, perché può dirti non solo se nel tuo materiale di partenza era presente DNA amplificabile, ma se tutto va bene, quanto - è quantitativo. Tuttavia, non ti dice quale fosse il prodotto PCR amplificato; le macchine possono essere cieche alla natura del prodotto. Senza un'attenta calibrazione, questo può essere un problema.
La PCR funziona solo sul DNA
Avrai notato che l'elenco delle informazioni genetiche sopra escludeva i virus. Sebbene i genomi di molti virus - come l'influenza - siano anch'essi fatti di DNA, l'informazione genetica degli altri è diversa: usano una molecola correlata chiamata RNA. I coronavirus ( es. COVID-19) fanno parte di questo secondo gruppo: usano l'RNA come materiale genetico. Ma la PCR non funziona sull'RNA, richiede il DNA. Quindi la PCR della Figura 1a non funzionerà per amplificare il materiale genetico COVID-19, che è fatto di RNA.
Fortunatamente, c'è una soluzione per questo: possiamo prima fare una copia del DNA dell'RNA. Questo ci porta alla "RT" in "RT-PCR". In RT-PCR, c'è una fase iniziale in cui l'enzima trascrittasi inversa (RT) utilizza l'RNA per creare una copia del DNA, quindi la PCR può utilizzare questa copia come mostrato nella Figura 1a. In determinate circostanze, la RT-PCR può essere valutata in "tempo reale" (qRT-PCR) utilizzando macchine, come descritto sopra. Questo è un approccio potente e ampiamente adottato nella ricerca. Può dire ai biologi molecolari quanto di un certo tipo di RNA è presente in un campione, ad esempio se una biopsia umana contiene un livello malsano di RNA associato al cancro. Un simile approccio qRT-PCR viene anche adottato per determinare se i campioni contengono il genoma del virus COVID-19. Dato che molto è in gioco con questo approccio, è probabilmente saggio essere consapevoli delle sfide e dei limiti della qRT-PCR in generale.
qRT-PCR come un'arma a doppio taglio
La straordinaria sensibilità dei metodi basati sulla PCR è sia il loro esonero che la loro potenziale caduta. Ogni ciclo PCR raddoppia la quantità di materiale, il che potrebbe non sembrare impressionante, ma lo è davvero. Per illustrare ciò, immagina di essere appollaiato in cima alla torre del Big Ben (96 metri di altezza) e raddoppia la lunghezza ogni secondo. Entro 22 secondi (22 raddoppiamenti), viaggerai alla velocità della luce (a parte la Relatività Speciale). Quindi, se qualcosa va storto nella PCR, si amplifica rapidamente un risultato aberrante a proporzioni sbalorditive. Sebbene varia, i ricercatori sono tipicamente interessati all'amplificazione PCR che diventa rilevabile entro 25-35 cicli (raddoppio), indicato come valore di soglia (C t) e discusso di seguito. Passiamo ora ad alcuni dei problemi nella qRT-PCR che i laboratori di ricerca sono scrupolosamente attenti a garantire o da cui guardano.
Specificità dei primer PCR
La specificità del primer è fondamentale, perché desideri amplificare la tua sequenza di interesse, nient'altro. Sebbene rappresentata qui in modo semplicistico, questa specificità ha molto a che fare con la forma del primer e, ahimè, non è una cosa binaria. La Figura 1b mostra come i primer possono legarsi a regioni di DNA che hanno una forma simile al bersaglio, ma sono differenti. Questo legame è meno efficiente di quello in buona fede, target previsto, ma ci sono molti più "target simili" rispetto ai target previsti, quindi, con un tempo sufficiente, si verificherà il legame del primer a non target. Il legame del primer è anche influenzato dalla composizione chimica della reazione PCR. Nei laboratori di ricerca, questo può essere attentamente standardizzato, ma è più difficile farlo se i campioni provengono da fonti diverse, ognuna unica, come il contenuto del naso o della gola di persone sottoposte a screening in tutta la popolazione. Si noti che gli eventi di legame dei primer indesiderati devono verificarsi solo due volte, poiché il prodotto PCR risultante ha quindi sequenze di primer a ciascuna estremità che si adattano perfettamente ai cicli successivi. Se la reazione PCR ha prodotti di dimensioni diverse man mano che procede, quello più corto tende a predominare, quindi se il legame del primer indesiderato genera un prodotto corto, sarà amplificato preferenzialmente, ma la macchina per PCR non te lo dirà. Le reazioni PCR contenenti più coppie di primer ("multiplexing") hanno maggiori possibilità di produrre prodotti indesiderati perché ci sono ancora più "target look-alikes".
Transcrittasi inversa: la "RT" nella qRT-PCR
La trascrittasi inversa (RT) è un enzima sensibile e si "spegne" facilmente, quindi deve essere conservato a bassa temperatura. Buoni laboratori di ricerca lo convalidano in ogni esperimento. Ma d'altra parte, supponiamo che la trascrittasi inversa funzioni quando c'è poco RNA presente nel campione ma molto DNA. La trascrittasi inversa è attratta a fare una copia del DNA, forse piuttosto che dell'RNA? Sì. Quindi quanto DNA conteniamo ognuno di noi?
DNA e RNA in campioni qRT-PCR
Con alcune ipotesi di base, il materiale genetico (DNA) nella maggior parte dei nuclei delle cellule umane è lungo 12,8 miliardi di basi. Se calcoli quanto questo rappresenta in un'intera persona - tu - è davvero sorprendente: c'è abbastanza DNA in ognuno di noi (più o meno) per fare 431 viaggi di andata e ritorno verso ... il sole (da Droitwich). Anche se esistessero 100 genomi di RNA del virus COVID-19 per cellula e fosse copiato in modo efficiente dalla trascrittasi inversa, ci sarebbe oltre 4.000 volte più DNA genomico. Laddove possibile, e in generale, i laboratori di ricerca adottano quindi misure attente per purificare l'RNA o rimuovere il DNA prima di iniziare il protocollo qRT-PCR. Questo non funziona sempre in modo ideale, quindi ci sono controlli importanti, come eseguire la reazione senza la fase RT; se rilevi un prodotto in questa situazione, sai che qualcosa è andato storto, poiché la PCR non funziona sull'RNA, la fase RT dovrebbe essere critica. Un'ulteriore complicazione è che le cellule umane sane contengono fino a 5 volte più RNA del DNA. Tutto ciò significa che i campioni umani contengono ampio materiale per l'amplificazione fuori bersaglio.
Numero di ciclo
La maggior parte delle applicazioni di ricerca limita il numero di cicli qRT-PCR. Più tecnicamente parlando, questo è determinato dal numero di cicli di soglia - o C t - che è il numero di cicli PCR al quale c'è abbastanza prodotto per dare un segnale che è al di sopra del livello di fondo. Nella ricerca, i valori C t sono spesso ben al di sotto dei 30 anni e quelli molto superiori ai 35 possono semplicemente riflettere i livelli di fondo. (È leggermente più complicato perché è più probabile che un segnale PCR venga rilevato maggiore è il materiale di partenza, quindi i ricercatori determinano il relativoquantità di prodotto; lo salteremo qui, poiché non influisce sui falsi positivi.) L'aumento del numero di cicli aumenta anche la possibilità di rilevare legami di primer non specifici. Fondamentalmente, le macchine PCR non distinguono tra segnali "falsi" e quelli che provengono dai target previsti durante la PCR; la macchina misura i livelli del prodotto, non qual è il prodotto. Solo con un sistema gel, sequenziamento o qualche altro metodo, la natura del prodotto PCR diventa più chiara e questi controlli vengono utilizzati nella ricerca, in particolare quando si imposta un esperimento. Altrimenti, la macchina può tranquillamente registrare un prodotto che non ha nulla a che fare con il target previsto e non lo saprai mai senza controlli aggiuntivi.
Contaminazione con DNA amplificabile
Questo è un aspetto straordinario della sensibilità della PCR e affligge tutti i laboratori che lo utilizzano, specialmente quelli che spesso amplificano lo stesso tipo di prodotto PCR da campioni diversi. La natura della contaminazione da PCR può sembrare magica per i principianti: in qualche modo, una quantità incredibilmente piccola di prodotto dalla PCR della scorsa settimana è arrivata oggi. E questa contaminazione può essere causata da una singola molecola. La contaminazione viene rilevata dai controlli negativi, come una reazione PCR in cui non ci si aspetta alcun prodotto, come impostare tutto ma tralasciare il campione o la trascrittasi inversa. Ma poiché la contaminazione è un dolore così grave, di gran lunga l'approccio migliore è evitare la contaminazione in primo luogo, piuttosto che rilevarla dopo che è accaduta. Per questo motivo, nella maggior parte dei laboratori vengono prese precauzioni speciali per evitare contaminazioni, come l'utilizzo di puntali con barriera aerosol (che sono costosi) per pipettare, cambiare frequentemente i guanti, utilizzare materiali dedicati e lavorare in un'area regolarmente pulita e dedicata. Questo è costoso. Se c'è contaminazione, gli esperimenti devono essere interrotti fino a quando non viene sradicata. Ciò richiede tempo, frustrante, può richiedere giorni e può anche essere costoso. Le soluzioni e gli enzimi devono essere testati e scartati se si sospetta che ne siano una fonte. Anche le pipette e le macchine possono essere la fonte di contaminazione e devono essere spurgate se questo risulta essere il caso. La contaminazione a volte è palese, come quando tutte le reazioni PCR danno prodotti, anche se ci si aspettava che solo alcune (o nessuna). Ma può essere sottile perché la quantità di materiale contaminante è inferiore; in questi casi, solo alcune reazioni PCR producono un prodotto a causa della contaminazione.
Commenti conclusivi
Questo è un riassunto tecnico privato di quanto più gergo possibile. Poiché si riferisce a COVID-19, non copre i cosiddetti positivi "freddi", in cui l'RNA del virus (inclusi i frammenti di RNA) è presente in campioni che non contengono virus vitali o infettivi e tuttavia possono ancora dare un positivo segnale. Ma dovrebbe evidenziare che sebbene la qRT-PCR sia immensamente potente nella ricerca, le sue potenziali insidie richiedono misure di salvaguardia puntigliose. Nella ricerca, ogni esperimento viene eseguito con campioni indipendenti in almeno due occasioni: un requisito minimo per la pubblicazione da parte di riviste rispettate. L'interpretazione dei risultati qRT-PCR sia positivi che negativi richiede un'esperienza che è molto abbondante tra i biologi molecolari che lavorano sui sistemi eucariotici, e ci si chiede fino a che punto sono stati chiamati a fornire consulenza sul test COVID-19.
Figura 1. Reazione a catena della polimerasi, PCR. a, La quantità di primer per PCR non ha limiti e di solito i primer corrispondono perfettamente al loro target. Il principio della PCR funziona in qRT-PCR. b, In un mondo ideale, ogni primer è specifico per il suo target previsto, ma in realtà possono corrispondere a "target sosia". Sebbene questi non funzionino bene come gli obiettivi previsti, ci sono molti più simili (rispetto agli obiettivi previsti) e vincolarli solo in due occasioni può essere sufficiente per produrre un non intenzionale ("falso") positivo.
Fonte
https://lockdownsceptics.org/false-positives-in-pcr-a-primer/
